Проточная цитометрия в диагностике лимфопролиферативных заболеваний

Заболеваемость злокачественными заболеваниями кроветворной и лимфоидной ткани (гемобластозами) с каждым годом увеличивается во всем мире.

По данным канцер-регистра Республики  Беларуси, за 1999-2008 гг. стандартизованные показатели заболеваемости лейкозами и лимфомами составляли 20,1 на 100 000 населения. Неуклонно увеличиваются показатели смертности больных с лейкозами и злокачественными лимфомами.

 

Уровень 5-летней выживаемости больных с гемобластозами остается по-прежнему низким.

 

Под термином "лимфома" понимают большое количество различных видов заболевания, существенно отличающихся друг от друга по своим проявлениям и подходам к их лечению. Все лимфомы разделяют на 2 большие группы: лимфома Ходжкина (ЛХ) и неходжкинские лимфомы (НХЛ). Решение о принадлежности лимфомы к группе неходжкинских лимфом или к болезни Ходжкина принимается после гистологического исследования образца биопсированной ткани. Если при микроскопическом исследовании находят специфические для болезни Ходжкина клетки Березовского-Штернберга-Рида, то ставят диагноз болезни Ходжкина. Если эти специфические клетки не находят, то лимфому относят к группе неходжкинских. Неходжкинские лимфомы (НХЛ) — гетерогенная группа злокачественных лимфопролиферативных опухолей, различающихся по биологическим свойствам, морфологическому строению, клиническим проявлениям, ответу на терапию и по прогнозу. Вероятность развития неходжкинских лимфом значительно повышается с возрастом — почти в 20 раз после 80 лет. По темпу прироста заболеваемость НХЛ опережает ЛХ. Средний возраст пациентов с НХЛ 50-60 лет.

За 170 лет изучения злокачественных НХЛ, в отличие от ЛХ, претерпели множество терминологических изменений: лимфосаркома, злокачественная лимфома, лимфобластома, ретикулосаркома, гематосаркома и др., что свидетельствует о клинико-морфологической сложности данной группы заболеваний.

Этиология неходжкинских лимфом недостаточно ясна. Установлена роль вируса Эпштейна–Барр в возникновении одной из редких форм — лимфомы Беркитта. Риск развития НХЛ значительно повышается при ВИЧ-инфекции, первичных и вторичных иммунодефицитах. В настоящее время установлено, что НХЛ — злокачественная опухоль из клеток иммунной системы клонального характера. Изучается роль человеческого Т-клеточного лимфотропного вируса I-го типа и вируса герпеса. Наследственные факторы в возникновении НХЛ не имеют существенного значения. Отмечено увеличение заболеваемости НХЛ при длительном контакте с пестицидами. Лимфома Ходжкина - название введено Всемирной Организацией Здравоохранения (ВОЗ) в 2001г., - это опухолевое  заболевание  лимфатической системы. Впервые описано  Томасом Ходжкиным в 1832 г. Хотя риск развития лимфомы Ходжкина достаточно низок – 0,24% среди мужчин и 0,2% среди женщин, около 15% всех случаев приходится на молодой возраст – от 15 до 24 лет. Лимфома Ходжкина имеет  уникальную бимодальную (иногда трёхмодальную) возрастную кривую - заболеваемость имеет два пика - первый приходится на возраст 15-40 лет, а второй постепенно нарастает после 50 лет.

Хронические лимфопролиферативные заболевания (ХЛПЗ) объединяют целую группу биологически различных опухолей, возникающих в результате накопления и/или пролиферации клональных морфологически зрелых лимфоцитов. Сама природа этих клеток делит заболевания на две большие группы: Т-клеточные и В-клеточные хронические лимфопролиферативные заболевания, внутри которых на основании клинических проявлений и опухолевого происхождения выделяют:

• собственно лейкозы, всегда протекающие с вовлечением периферической крови;
• лейкемическая стадия (лейкемизация) лимфомы, при которой источником заболевания является периферическая лимфоидная ткань, но клинические проявления, ответ на ХТ и прогноз соответствуют лейкозу;
• лимфоматозные формы, при которых кровь крайне редко вовлекается в патологический процесс.

Иммунофенотипическая диагностика ХЛПЗ по фенотипическому профилю клеток периферической крови возможна только в двух ситуациях:

• при выходе в системный кровоток опухолевых (трансформированных) лимфоцитов зрелоклеточной морфологии (пролимфоцитарный, лимфоцитарный, волосатоклеточный лейкозы);
• при лейкемизации лимфомы, когда происходит экспансия опухолевых клеток в периферическую кровь и костный мозг (фолликулярная лимфома, лимфома клеток маргинальной зоны, лимфомы скоплений лимфоидной ткани, ассоциированной со слизистыми, лимфома селезенки с отросчатыми (ворсинчатыми) лимфоцитами, лимфома кожи.

Проведение диагностического ИФТ оправдано при выявлении в периферической крови абсолютного и относительного лимфоцитоза. Пороговый уровень лимфоцитоза, при котором считается необходимым проводить диагностическое ИФТ за последние годы снизился с 10х10⁹/л [74] до 5х10⁹/л.

С начала 80-х годов ХХ века, когда развитие гибридомной технологии позволило получать моноклональные антитела любой специфичности, стало возможным нарастающее по сложности и объему информации иммунофенотипирование.

Проточная цитометрия (ПЦ) является интегральным инструментом изучения различных биологических систем с помощью регистрации флюоресценции и использования флюоресцентных красителей, способных связываться с различными компонентами клетки.

В основе метода проточной цитометрии лежит измерение оптических свойств клеток. Клетки по одиночке вводятся в ламинарный поток в проточной кварцевой кювете, где они пересекают сфокусированный световой пучок, не касаясь стенок кюветы. Источником света могут быть различные лазеры, ультрафиолетовая лампа или их комбинация. Свет определенной длины волны возбуждает молекулы флуоресцирующих красителей, связанных с различными клеточными компонентами, при этом может происходить одновременное возбуждение нескольких разных красителей, что позволяет оценивать сразу несколько клеточных параметров. Свет, испускаемый красителями, собирают с помощью системы линз и зеркал и раскладывают на компоненты. Световые сигналы улавливаются и преобразуются в электрические импульсы фотоумножительным устройством. Далее информация обрабатывается в цифровом режиме. Величины, измеренные фотоумножителем, отображаются на гистограммах. Современные проточные цитофлуориметры позволяют одновременно измерять несколько (до восьми) параметров: рассеяние света на малые углы (до 10°), которое еще называют прямым светорассеянием (forward scattering или FSC); рассеяние света на угол 90°, т.н. боковое светорассеяние (side scattering или SSC]; интенсивность флуоресценции на разных длинах волн. Параметры светорассеяния позволяют проводить разделение клеток по размерам, форме, состоянию клеточной мембраны и характеристикам цитоплазмы.

Традиционно концентрация клеток определяется путем разделения пробы на две части и сравнение результатов анализа иммунофенотипирования, выполненного на проточном цитометре с результатами подсчета клеток на гематологическом анализаторе. Такая процедура приводит к дополнительным затратам времени, средств и мощностей лабораторного оборудования. В настоящее время на рынке имеются наборы калибровочных частиц для определения концентрации клеток непосредственно на проточном цитометре, однако их использование также связано с дополнительными затратами. Проточные цитометры являются полностью открытыми системами, что не ограничивает пользователя в выборе реагентов.

При анализе клеток, маркированных двумя, тремя или четырьмя антителами, коньюктированными с различными цветовыми метками, необходимо проводить компенсацию сигналов с флуоресцентных каналов проточного цитометра из-за перекрытия спектров эмиссии используемых красителей.

Проточная цитометрия позволяет определить долю клеток, находящихся в S-фазе и оценить степень пролиферации. С помощью ДНК-гистограмм возможно четко разделить клетки, находящиеся в G1-, S- и G2/M-фазах клеточною чикла. Совокупность информации о содержании ДНК, маркеров апоптоза и клеточной пролиферации, имеет важное значение в дифференциальной диагностике онкологических заболеваний крови и солидных опухолей.

Диагностика лейкозов, лимфом в настоящее время одна из наиболее передовых областей использования проточной цитометрии. Иммунофенотипирование клеток крови и костного мозга обеспечивает ключевой информацией для качественной диагностики и оценки прогноза заболевания.

Трансплантация костного мозга (ТКМ) при лимфомах и лейкозах предполагает перенос стволовых мультипотентных клеток, ответственных за восстановление нормального гемо- и лимфопоэза, в противоположность гемотрансфузиям, которые дают временный эффект. Кроветворные клетки для ТКМ могут быть получены из костного мозга, периферической и пуповинной крови. Процедура ТКМ более не является экспериментальным методом, а составляет важный компонент в лечении онкологических и наследственных заболеваний. Рецептор CD34 используется как маркер полипотентных кроветворных стволовых клеток. Подсчет абсолютного числа CD34+ клеток при помощи проточной цитометрии является золотым стандартом в оценке количества кроветворных клеток.

Таким образом, проточная цитометрия имеет достаточно широкие возможности для решения различных диагностических и исследовательских задач, делая лабораторное исследование технологичным, точным и своевременным.

Широкие возможности ее применения связаны с тем, что интенсивность флюоресценции прямо пропорциональна количеству контролируемого вещества в клетке, однако при определенных условиях могут быть зарегистрированы очень малые количества флюорохрома, в том числе меньше 1000 молекул на клетку. Некоторые флюоресцентные красители могут менять параметры флюоресценции внутри живых клеток и превращаться из нефлюоресцирующих во флюоресцирующие под воздействием определенных ферментов, изменять спектр флюоресценции под действием ионов кальция, их можно применять при конструировании молекулярных зондов.

Возможности ИФТ в прогнозировании течения и исхода онкогематологических заболеваний во многом определяются адекватным набором антител для первичной диагностики.

Развитие технологий в области мультипараметрического анализа, гейтирования по CD45, автоматизированного анализа кластеров и стандартизации аппаратуры достаточно быстро перевело проточные цитометры из разряда приборов научного использования в рутинное оборудование клиник и сделало саму ПЦ стандартом лабораторной диагностики в области иммунофенотипирования клеток. Выявление молекул, тем или иным образом интегрированных с клеточной мембраной, является только одной из сфер применения ПЦ, но именно она имеет максимальное диагностическое значение.

Все большее количество определяемых параметров позволяет изучать все более сложные фенотипы нормальных и злокачественных лейкоцитов, и, следовательно, все более тонкие аберрации, выделяющие опухолевую клетку в присутствии нормальных клеточных компонентов крови и костного мозга.         Эти возможности и превратили проточную цитометрию в метод выбора при определении линейной принадлежности и уровня созревания злокачественных клеток при острых лейкозах и лимфомах.

Виды биологического материала, направляемого на тестирование для выявления лейкоза/лимфомы и определения их природы, достаточно разнообразны: периферическая кровь, аспират костного мозга, трепанобиоптат, взвесь клеток лимфатического узла, ликвор, плевральная жидкость.  

Мультипараметрический анализ позволяет уменьшить необходимый объем образца, время пробоподготовки и фактического анализа, сокращая тем самым путь от получения биологического материала до клинического результата – иммунофенотипического диагноза. Проточная цитометрия предоставляет три типа данных:

• необработанные данные интенсивности флюоресценций в формате, определяемым программным обеспечением прибора;
• относительное содержание (%) различных клеточных популяций по оценке врача, проводящего анализ биологического материала;
• информация по единичным маркерам, имеющим принципиальное значение для клиники (например, CD34⁺ при исследованиях в области гемопоэтических стволовых клеток (ГСК)).

Последующая экспертная оценка всей совокупности данных, ведущая к установлению диагноза является дополнительным источником вариабельности окончательных результатов за счет выбора метода оценки антигенной экспрессии и критериев интерпретации первичных данных.

Мультипараметрические возможности оценки клеток стали использовать для выявления фенотипических аберраций лейкозных клеток с максимальной вероятностью специфических генетических поломок для подтверждения которых необходима молекулярная диагностика. Известно, что среди пациентов с идентичным, в том числе нормальным, кариотипом или генетическими аберрациями прогрессия заболевания различна и не всегда предсказуема, что требует поиска дополнительных критериев информации, которыми могут оказаться данные ИФТ. При невозможности получить метафазные пластинки выявление хромосомных аберраций может быть осуществлено с помощью молекулярных проб и определения профиля экспрессии генов в злокачественных клетках. Немногочисленные работы применения микроэррей-технологии при острых лимфобластных лейкозах показали перспективность этого направления при поиске новых прогностических признаков генетических нарушений и прогноза заболевания. К сожалению, молекулярно-биологические исследования не являются рутинными для многих, в том числе специализированных, клиник, а там, где осуществляются, получение информации значительно дистанцировано во времени от получения биологического материала. С клинической точки зрения, это, скорее, подтверждающие (или отрицающие) диагноз исследования, но не определяющие его.

Для проведения иммунофенотипической диагностики лейкозов и лимфом необходимо выделить клетки, являющиеся субстратом заболевания. До появления методических возможностей работы с цельной кровью (костным мозгом) при диагностике гемобластозов только использование градиентного центрифугирования создавало возможность анализа трансформированных клеток, патологических лимфоцитов и бластов. За такое увеличение относительного содержания опухолевых клеток приходилось платить потерей возможности оценить клеточный состав образца в целом. Поэтому, если еще в середине 90-х годов ХХ века выделение мононуклеаров на градиенте плотности расценивалось как обязательный этап пробоподготовки, то позднее пришли к однозначному предпочтению лизиса при работе с образцами онкогематологических пациентов.

Для определения возможности проведения ИФТ необходима информация о количестве лейкозных бластов в образце, так как при их низком содержании (менее 20%) фенотипический профиль бластной популяции может быть оценен неправильно. Принято считать, что относительное содержание бластов указано в миелограмме, сопровождающей костный мозг, направляемый на ИФТ. Однако на практике нередко материал стернальной пункции одновременно направляется морфологу для получения детальной миелограммы и иммунологу для определения варианта лейкоза, т.е. клеточность образца неизвестна. Кроме того, возможное разведение костного мозга периферической кровью может серьезно влиять на конечный результат исследования. Следствием этого оказывается необходимость вносить специфические антитела в избытке, а не из расчета на количество клеток. Для определения уровня бластоза при ПЦ необходимо средствами программного обеспечения отделить собственно клетки от дебриса и сдвоенных клеток, которые могут в разном количестве присутствовать в анализируемом образце и особенно часто выявляются при хронических лимфопролиферативных заболеваниях.

Основной задачей ИФТ является получение информации, которая позволяет установить факт наличия гемобластоза и его иммунологический вариант, а последующая их интерпретация предполагает интегральный анализ ИФТ и других клинических и лабораторных данных.

Литература

1. Вопросы современной проточной цитометрии. Клиническое применение. // Под ред. Хайдукова С.В., Зурочки А.В. Челябинск. Издательство "Челябинская государственная медицинская академия". 2008, 196 С.
2. Луговская С.А., Почтарь М.Е., Тупицин Н.Н. Иммунофенотипирование в диагностике гемобластозов, Кафедра КЛД, Москва, 2005.
3. Immunobiology, 6-th edition, Garland Science, New York and London, 2005.
4. Ярилин А.А. Основы иммунологии, Москва, «Медицина», 1999.
5. Kretowski A, Mysliwiec J, Turowski D, Wysocka J, Kinalska I. Analysis of recently activated, memory and naive lymphocyte T subsets in the peripheral blood of patients with Graves' disease and insulin-dependent diabetes mellitus. Rocz Akad Med Bialymst. 1999; v.44: 226-34.
6. Зуева Е.Е. Иммунофенотипирование в диагностике острых лейкозов, Российский
7. Биомедицинский Журнал, 2003, т.4, ст.132, стр. 471-478.
8. Чередеев А.Н., Горлина Н.К., Козлов И.Г. CD-маркеры в практике клинико-диагностических лабораторий, Клиническая лабораторная диагностика, 1999, №6, c.25-31.
9. Laurence J. T-Cell Subsets in Health, Infectious Disease, and Idiopathic CD4+T Lymphocytopenia, Annals of Internal Medicine, 1993; 119 (1), p.55-62
10. Reichert T, De Bruyere M, Deneys V, Totterman T, Lydyard P, Yuksel F, et al. Lymphocyte subset reference ranges in adult Caucasians. Clin Immunol Immunopathol.1991; 60:190-208.
11.  Применение проточной цитометрии для оценки функциональной активности иммунной системы человека, пособие для врачей-лаборантов, Москва 2001.
12. Поддубная И.В. Иммунодиагностика гемобластозов. Клиническая онкогематол. М.: Медицина, 2001; c. 336-75.